|
|
[回上頁 | 顯示此文件為可列印格式]
此文件提供者： shuYing - [評分 : 0.00 (0 票選) | 評分！]
蛋黃稀釋液與低密度脂蛋白
作為精子冷凍保護機制及其效應
新竹分所 李佳馨、蕭振文、葉亦馨、楊明桂
在精子冷凍過程中所使用之稀釋液(extender)、平衡培養時間以及冷凍過程等，均會影響精子冷凍解凍後之存活率及精子之受精能力。其中以蛋黃(eggyolk,EY)早已被證實對精子具有冷凍保護效果，可降低精子於冷凍過程受到冷休克之影響。且蛋黃稀釋液已廣泛運用於冷凍稀釋液60餘年，但近年已有許多學者提出蛋黃稀釋液之負面效應：(1)蛋黃為一營養生物培養液，可促進細菌與微生物孳生，故可能導致精液汙染發生，(2)蛋黃中之顆粒物質，會阻礙精子之代謝轉換作用或降低精子活動力及(3)蛋黃可能干擾精子生化檢驗分析結果等。以特定物種來說，山羊精液中由尿道球腺所分泌之蛋黃凝集酵素(egg
yolk-coagulating enzyme, EYCE)可將蛋黃中之卵磷脂(lecithin)水解出不飽和脂肪酸(unsaturated
fatty acid)，其中脫羧卵磷脂(lysolecithin)具有高毒性，而其他不飽和脂肪酸所產生之酸性環境亦對精子有害。因此，尋求蛋黃稀釋液之替代物有其必要。
最早由蛋黃中觀察到低密度脂蛋白(low
density lipoprotein, LDL)是由(1974年)Pace
和Graham兩個學者，他們以高速離心方式分離出低密度脂蛋白及高密度脂蛋白(Hight density lipoprotein, HDO)，初步試驗中提出，LDL具有保護精子對抗低溫環境的能力，並觀察到高密度脂蛋白對精子有抑制作用。Demianowicz和Strezek
(1996)將蛋黃分成兩種脂蛋白：LDL和高密度脂蛋白(HDL)。他們觀察到，如果LDL比卵黃提供更好的保護公豬精子，HDL與卵黃相比顯著降低精子運動力，並指出它是由於HDL中包含的顆粒。
LDL主要由蛋黃中所萃取出。LDL的結構大約由87%的脂質及12%的蛋白質所組成，其中脂質中三酸甘油脂佔 69%磷脂質佔26%及5%的膽固醇脂，形成一個直徑約35nm球形結構。皮膜部主要由磷脂質與蛋白質所組成，LDL內部則由三酸甘油脂及膽固醇脂所組成(圖一)。Hu等人(2010)利用超高速離心方式純化蛋黃液，發現蛋黃中之低密度脂蛋白 (low density lipoprotein, LDL)成分具有抗凍能力，可附於於精子細胞膜表面，穩定細胞膜之結構，對於冷凍解凍後之精子活力有較佳之表現，於稀釋液中添加8%LDL具有較佳之精子存活率與精子動力參數，且有利於精子維持較高之粒線體活性、頭帽與DNA完整性以及過氧化氫酶 (Catalase, CAT)、穀胱甘過氧化酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)與穀胱甘肽 (glutathione, GSH)等抗氧化酶活性。由於精子細胞膜中含有較多之不飽和脂肪酸，使其容易受到O2-及H 2O2的損傷，因此，細胞膜在冷凍或冷休克損傷時最先受到影響。保護精子抗氧化系統主要源自細胞質，但精子在細胞分化的過程中將細胞質排出於精子外，因此細胞質內缺乏有效的抗氧化物質成分，以抵抗活性氧(ROS)和脂質過氧化物質(Lipid peroxidation, LPO)所造成的破壞性效應。因此，精子細胞對過氧化損傷特別敏感，尤其是在冷凍保存後-隨後膜完整性喪失，細胞功能受損，運動性和受精能力降低。
由於蛋黃和LDL在冷凍過程中，保護精子的確切機制是未知的。Amirat等人(2005)以電子顯微鏡觀察冷藏於4℃下(圖二)，添加EY及LDL稀釋液中之精子，在EY稀釋液處理組於冷藏於4℃、1小時候發現有大量之蛋黃顆粒物質吸附於精子表面，其中觀察到有18％的精子質膜破裂，36%之精子有頂體反應或裂解之情形，僅46%的精子是完整的，而LDL處理組之精子質膜破裂僅佔0.28%，其精子完整性佔99.07%。其作者推測蛋黃顆粒物質會引起頂體反應(acrosomal reaction)或裂解作用而使精子死亡。
另精漿主要是公畜在射精時與附睪中之精子混和後，作為攜帶精子至雌性生殖道之載體。除此之外，精漿中之成分也提共精子活力，存活力及促進獲能作用所需。但也包含一些不利精子受精能力之因子，如去獲能因子、精子活力抑制因子，還有一些不利精子貯存之因子。其中早已由學者提出BSP蛋白，在公牛射精時結合到精子表面之膽鹼磷脂，可能藉由高密度脂蛋白和肝素誘導精子獲能作用，並進一步刺激精子細胞膜之膽固醇及磷脂之流失。Bergeron等人(2004)探討公牛精漿蛋白(bull seminal plasma protein, BSP如BSP-A1/A2，BSP-A3和BSP-30-kDa)與TG、EY及LDL稀釋液間之作用。研究顯示，精液中添加含有EY或LDL之稀釋液，其精子BSP蛋白量會減少50%-80%，並且在培養期間細胞膜之脂質顯著增加。由於LDL可與BSP蛋白產生螯合作用，可減少BSP主要蛋白與精子的結合，阻止精子細胞膜脂質流出，推測此應該是蛋黃與LDL稀釋液可作為精子冷藏冷凍之保護機制。
綜合上述，8%LDL可作為公牛精子冷凍稀釋液之良好介質，可避免蛋黃所造成之負面效應，並保護精子冷凍解凍後之線粒體活性、頭帽完整性、DNA完整性，以及CAT、GSH-Px與GSH之抗氧化酶活性。
後續已有許多作者提出，蛋黃中低密度成分，主要由LDL組成，可抗冷休克和改善儲存後精子的運動性。
|
 |
|
圖二、為精子頭部在電子顯微鏡下觀察冷藏於4℃達1小時的情形。
Bars = 1mm. (a)Triladyl ( X 41 800). (b) LDL ( X 31 400). (c)
Biociphos ( X 24 300). |
參考文獻
Amirat, L., D. Tainturier, L. Jeanneau, C. Thorin, O. Gerard, J. L. Courtens,
and M. Anton. 2004. Bull semen in vitro fertility after cryopreservation
using egg yolk LDL: a comparison with Optidil, a commercial egg yolk
extender. Theriogenology 61:895-907.
Amirat, L., M. Anton, D. Tainturier, G. Chatagnon, I. Battut, and J. L.
Courtens. 2005. Modifications of bull spermatozoa induced by three
extenders: Biociphos, low density lipoprotein and Triladyl, before, during
and after freezing and thawing. Reproduction 129:535-543.
Bergeron, A., M. H. Crete, Y. Brindle, and P. Manjunath. 2004. Low-density
lipoprotein fraction from Hen’s egg yolk decrease the binding of the major
protein of bovine seminal plasma to sperm and prevents lipid efflux from the
sperm membrane. Biol. Reprod. 70:708-717.
Demianowicz, W., J. Strezek. 1996. The effect of lipoprotein fraction of egg
yolk on some of the biological properties of boar spermatozoa during storage
of the semen in liquid state. Reproduction in Domestic Animals 31:279-280.
Hu,
J. H.,
Q. W.
Li, L.
S. Zan,
Z. L.
Jiang, J.
H. An,
L.Q. Wang,
and Y.
H. Jia.
2010. The
cryoprotective effect of
low-density lipoproteins in
extender on
bull spermatozoa following
freezing-thawing. Anim.
Repro. Sci.
117:11-17
Hu,
J. H.,
Z. L.
Jiang, R.
K. Lv, Q.
W. Li,
S. S.
Zhang, L.
S. Zan, Y.
K. Li,
X. Li.
2011. The
advantages of low
density lipoproteins
in the
cryopreservation of
bull semen.
Cryobiology 62:83-87
Moussa, M., V.
Martinet, A.
Trimeche, D.
Tainturier, M.
Anton. 2002.
Low density
lipoproteins extended from
hen egg
yolk by
an easy
method: cryoprotective
effect on
frozen-thawed bull semen.
Theriogenology 57:1695-1706.
Pace, M.
M., E. F.
Graham. 1974.
Components in
egg yolk
which protect
bovine spermatozoa during
freezing. Journal of
Animal Science
39:1144-1149.
[回上頁 | 顯示此文件為可列印格式]
此文件提供者： shuYing - [評分 : 0.00 (0 票選) | 評分！]
|
|
|
