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人工生殖技術：家畜胚鏡檢技術

MICROSCOPE EXAMINATION OF LIVESTOCK EMBRYO

推 廣 場 所：
　
台灣省畜產試驗所生理系
台南縣新化鎮牧場 112 號
電話：(06)5911884，5911211
傳真：(06)5911210
聯 絡 人 ： 陳立人先生

家畜胚檢查是什麼？

　　家畜胚檢查是依照不同的實驗或實驗操作目的，利用種種方式如顯微鏡檢查、生體染色法、組織化學法、呼吸測定法、體外培養法或移置法等，以判定家畜胚的正常與否並預測其後續之發育能力的操作。

家畜胚檢查法的用途如何？

　　家畜胚的正常與否，對於其後續發育及存活能力均有絕對之關聯。因此，在實驗的操作上，家畜胚檢查的實施乃是實驗成功與否，以及實驗結果重複一致性的關鍵所在。另外，由於不同發育階段的家畜胚對於各種胚操縱進行之適合性與耐受性亦有所差異；是故家畜胚檢查正可以使操作者嚴格操控實驗之進行，以提高胚操縱及其他有關胚的實驗之成功率。而在家畜胚移置的實驗工作進行上，胚檢查更是直接關係著胚移置的成功與否，以及提高胚於移置後的存活和發育率一個不可或缺的步驟。

家畜胚檢查所需器材

　　埋植（著床）前各階段的家畜胚於採集後，通常必須藉顯微鏡之助，方能順利地自胚沖集液中尋檢出來。因此顯微鏡檢查法乃是家畜胚檢查的各種方式中，最基本也是最重要的一種方式。以此方式檢查家畜胚，通常須具備下列器材：

  1. 無菌無塵操作檯或防塵罩
  2. 立體顯微鏡（目鏡 10×，物鏡 1 至 4×）
  3. 位相差或分光干涉顯微鏡（以倒立者為佳；目鏡 10×，物鏡 4、10、 20 及 40×）
  4. 恆溫水槽
  5. 吸胚針（口徑略較胚大即可）與玻璃培養皿（直徑 10 cm）
  6. 吸胚針連接管
  7. 胚培養液 (Dulbecco's modified phosphate buffered saline, DPBS)
  8. 錶玻璃（直徑 6 cm）
  9. 塑膠培養皿（直徑 6 及 10 cm）
  10. 酒精燈

以上第 5 至 9 項器材於使用前應預先予以適當方法滅菌處理後備用。

家畜胚檢查操作前的準備

一、吸胚針的製備
  1. 將市售之玻璃毛細管 (Blue-tip,Monoject Scientific Co.,) 或玻璃滴管洗淨乾燥後，於火燄上方加熱拉製成適當口徑之吸胚針；並將針口略加燒圓。
  2. 將吸胚針集中於 10cm 直徑之玻璃培養皿或其他適當之容器內，外包覆以鋁箔。然後以高溫高壓濕熱滅菌後貯於乾燥無塵處所備用。
二、培養液之製備

　　將 DPBS 調製好經 0.22 cm 過濾膜過濾滅菌後 貯於 -4℃ 冰箱中備用。使用之前予以加溫到 37℃ ，並通氣 (CO2) 培養 10 分鐘。

三、操作環境的清潔

　　將無菌無塵操作檯或防塵罩內部先以 70％ 酒精噴灑（注意放置在裡面的顯微鏡光學構造組件勿予噴灑），並以紫外光燈照射 15 分鐘以上。並於操作之前以酒精棉花擦拭操作檯面與顯微鏡除光學組件以外的暴露部份。

四、操作者的準備

　　操作者應先以肥皂或消毒劑刷洗雙手自手肘以下的部位，擦乾後，噴灑 70 ％ 酒精消毒。待酒精乾後，方可進行操作。

家畜卵與胚品質之等級分類

　　採行顯微鏡檢查法判定家畜的卵與胚品質良否之前，必須先行了解該種家畜的卵或胚於各個發育階段的型態特徵，分佈位置與發育時間的相互關係，以及各種不正常發育的情形，方能據以做最佳的判斷。經由顯微鏡檢查外視後家畜卵或胚通常可分為以下四等級：

  1. 優良 ( Excellent)級：具有該發育階段之典型外觀，卵或分溝細胞輪廓明晰，細胞質色調及脂質顆粒分布均勻。
  2. 普通 ( Good )級：較該發育階段之典型外觀略差或小部份變形；其他均同優良級者。
  3. 不良 ( Poor )級：其外觀有明顯的變形，卵細胞 或分溝細胞輪廓不明晰，細胞質色調或脂質顆粒分佈不均勻。
  4. 異常 ( Abbormal )級：其外觀變形情況十分明顯；構造不正常程度達 40%的胚體以上。

家 畜 胚 發 育 階 段 及 其 於 生 殖 道 內 之 位 置

配種後
天數		 胚　　發　　育　　階　　段（胚所在位置）
牛 綿　羊 山　羊 豬
1 1細胞
（輸卵管）		 1細胞
（輸卵管）		 1細胞
（輸卵管）		 1細胞
（輸卵管）
2 2∼4細胞
（輸卵管）		 2細胞
（輸卵管）		 3細胞
（輸卵管）		 2細胞
（輸卵管）
3 2∼4細胞
（輸卵管）		 2∼16細胞
（輸卵管到子宮角）		 4細胞
（輸卵管）		 4細胞
（輸卵管）
4 16細胞
（輸卵管到子宮角）		 桑椹胚
（輸卵管到子宮角）		 8細胞
（輸卵管）		 16∼32細胞
（輸卵管到子宮角）
5 16細胞
至桑椹胚
（輸卵管到子宮角）		 桑椹胚

（子宮角）		 16細胞

（輸卵管到子宮角）		 桑椹胚
至囊胚
（子宮角）
6 囊胚
（子宮角）		 囊胚至孵化囊胚
（子宮角）		 桑椹胚
（子宮角）		 早期至孵化囊胚
（子宮角）
7 孵化囊胚
（子宮角）		 孵化囊胚
（子宮角）		 囊胚至孵化囊胚
（子宮角）		 囊胚至孵化囊胚
（子宮角）

家畜卵與埋植前階段胚之型態概述：

一、排卵直後卵子
  1. 正常型態特徵：透明帶內為單一圓滿而充實之卵細胞，其側方可見有第一極體(First polar body) 。透明帶外為極度擴散且呈粘稠性之卵丘細胞層所包被。卵細胞在豬、牛及山羊為暗褐色且由散佈均勻之脂質顆粒所覆蓋。
  2. 異常型態：卵細胞（卵實質）部份凹陷或呈扁餅狀或嚴重皺縮。卵細胞胞膜破損，而致內容物逸出而散佈在透明帶內。卵細胞顏色淺淡，或甚至透明無色。卵細胞裂解成為二個或二個以上的球狀物。第一極體未釋出。透明帶破損或缺如。包被於透明帶外的卵丘細胞群未擴散、部份或全部缺如。
二、受精直後之受精卵
  1. 正常型態特徵： 透明帶外之卵丘細胞已脫落消失。透明帶上可見有附著精子穿突融解之不規則痕跡。透明帶與卵細胞間的空隙 （卵黃囊間隙，Perivitelline  space ）可見有二個色調較淺而亮的極體（第一及第二極體）。卵實質充實而圓滿，呈均勻之暗褐色調。
  2. 異常型態： 透明帶光滑平整，未見有任何精子穿突附著。卵黃囊間隙亦未見有任何穿入精子，極體只出現一個或甚至完全缺如。卵實質部份凹陷呈不規則狀或扁平皺縮或裂解成二個或二個以上之球狀物。卵細胞膜破損致內容物逸出於透明帶內。卵實質顏色淺淡或甚至透明。其造成原因可能是卵子未成熟完全，或是受精作用不正常所致。

豬受精直後卵子，可見到兩個極體。

三、溝裂期（二細胞期到桑椹期）
  1. 正常型態特徵： 透明帶上留有被精子穿突之痕跡（牛、豬與羊）或尚存有附著精子或穿入透明帶之精子（豬）。透明帶內的分溝細胞呈大小相近似之球形且做依三度空間排列緊湊而整齊。分溝細胞上有脂質顆粒均勻分佈使之呈典型的暗褐色調。極體可能直到四細胞期才會消失。
  2. 異常型態：可能具有以下一種或一種以上的型態：
    A.透明帶光潔完整，未有精子穿突附著的任何痕跡。或透明帶嚴重破損。
    B.分溝細胞數目不符合其發育時間階段所應具有之數目。
    C.分溝細胞間接合鬆散而不緊湊大小差異極明顯或裂解，或透明帶內有部份破
        損分溝細胞及細胞碎片。
    D.分溝細胞呈色過淡或過深，脂質顆粒分佈極度不平均。
    E.透明帶內有空泡狀之細胞球。
  3. 受精卵溝裂期階段的家畜胚經利用 15000×g， 7 分鐘 的條件離心後，可將脂質與其他細胞質顆粒集中於卵細胞一側，在分光干涉 (Nomarski) 或位相差 (Phase contrast) 顯微鏡下，可見到受精卵原核 (Pronuclei) ，與溝裂期胚分溝細胞的細胞核。這個操作可幫助操作者更確實地區分出透明帶內的細胞球狀物是正常的分溝細胞或是異常裂解形成類似分溝細胞的細胞球狀碎片。
  4. 哺乳動物的卵或胚分溝細胞之色澤與脂質顆粒量依動物種別而有所差異。在家畜中，以豬胚的脂質顆粒含量最多，且胚之褐色色調最深、山羊次之、綿羊更次之、而牛胚則脂質顆粒較少且色調較淺。

分溝細胞大小不一的異常牛胚。

　

配備有分光干涉組件的倒立顯微鏡。
四、緊湊桑椹期

　　家畜依種別不同，由桑椹期經緊湊化進入緊湊桑椹胚期的胚發育階段亦有所差異。在正常的情狀下，牛、山羊與綿羊的胚於 16 細胞期（桑椹期）之後期便會開始緊湊化，而豬胚緊湊化則出現在 32 細胞期之末期。

  1. 正常型態：胚分溝細胞間的界限不明顯，胚之所有分溝細胞形成一個外緣略有凹凸起伏而密實的胚體。胚之色澤呈現深色調之褐色。
  2. 異常型態：胚分溝細胞結合鬆散而不密實，或有球狀或不規則狀之細胞碎片出現。胚脂質顆粒及細胞色澤分佈極不均勻，或甚至部份成現空泡化之現象。

正常的牛桑椹胚(左)
與緊湊桑椹胚(右)。

　正常的牛囊胚。

　正常的山羊囊胚。

五、囊胚期（早期囊胚到孵化囊胚）
  1. 正常型態：家畜胚發育到緊湊化囊胚階段後期，便會由於液體的分泌積聚而形成囊胚腔，胚細胞亦漸區分為兩群。其中包圍囊胚腔且較大型者為日後形成胎盤的滋養層細胞群，而較小群且為滋養層細胞所包被、偏於胚體一側者，為將發育成胚體的內細胞群。在發育的過程中，囊胚因囊胚腔的擴大而使胚體漸大而發育為擴張囊胚，旋脫出透明帶而成為孵化囊胚。甫說出透明帶的孵化囊胚色調較淺且胚體與擴張囊胚大小近似。隨後便色澤漸深且直徑漸大漸漸形成帶狀的胚體。
  2. 異常型態：內細胞群極度不明顯或甚至缺如（這種現象者稱為假囊胚， pseudoblastcyst）。滋養層細胞破損，或部份與胚體分離。內細胞群分為二群或二群以上。囊胚腔嚴重蹋陷無法復原。

囊胚腔蹋陷的異常豬囊胚。 　

分溝細胞破裂，內容物散逸（右下）的異常牛胚。

　

埋植前豬胚之正常型態：

單細胞期

雙細胞期

四細胞期

八細胞期

十六細胞期

三十二細胞期，桑椹期

緊湊桑椹期

早期囊胚期

擴張囊胚期

孵化囊胚期(早期)

孵化囊胚期

胚鏡檢的注意情況：

　　家畜卵與胚的檢查，乃是各種有關家畜胚實驗研究與操作時，所必須執行的一個步驟。檢查的技術良否及檢查結果的正確性，均關係著後續操作結果的成功與失敗。另外家畜的胚檢查可因應不同的實驗目的而有多種方式可供採用。顯微鏡檢查法是最簡單最基本的方式；但由於其對於卵或胚體本身比其他檢查方式較不具有侵害性，故亦為各種胚操縱中，最常使用的方法。而在採用顯微鏡檢查法檢查家畜卵或胚時，操作者應先對家畜卵或胚本身的發育階段，典型外觀等了然於心。然後在熟練的無菌操作技術下，迅捷而正確地下判斷，以減少家畜的卵或胚暴露在體外狀態下的時間，提高其存活率及操作的成功率。

參考文獻：

  1. 陳立人、吳明哲，1991。豬胚外科採集技術與胚整齊度之分析。中畜會誌，20(2):175~187。
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聯絡人簡介：

　　陳立人 (Lih-Ren Chen) ：國立台灣大學碩士

　　　　　　　　　　　　現任台灣省畜產試驗所家畜生理系助理 

　




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