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學術園地

公牛冷藏與冷凍精液之應用

新竹分所  蕭振文、趙俊炫  生理組  劉振發

　　乳牛的性能改良，透過採集具優良遺傳能力的種公牛精液進行人工授精，同時進行後裔檢定育成年青種公牛以為傳承後補之用。因此，公牛冷凍或冷藏精液的研發與乳牛性能改良間有密不可分的關係。以前在各種抗凍劑尚未發現與商品化稀釋液未普遍應用時，公牛精液主要以新鮮或液態冷藏方式保存，隨著抗凍劑的發現及冷凍保存技術的持續改善，各種精子稀釋液被陸續開發，使公牛冷凍精液取代了傳統新鮮或冷藏精液，成為產業應用的主流。根據國外統計資料，全球每年生產的公牛精液總數量超過2億劑。這些公牛精液中，冷凍精液占95%，僅5%約400萬劑為冷藏精液。使用冷藏公牛精液的國家以紐西蘭為主，其他如法國、荷蘭、澳洲及東歐等國則少量應用。

◆公牛冷凍精液之應用
　　冷凍精液的成功開發與意外發現甘油可做為冷凍保護劑有關，因而開啟一個嶄新且成功沿用至今的精液保存系統。過去幾年，雖持續開發較佳的冷凍保存技術，但解凍後精子的存活率僅略高於50%。冷凍時造成精子緊迫的原因，來自於降溫過程的溫度改變、稀釋液配方組成、抗凍劑及最後解凍時的影響與傷害等。在降温過程，精子懸浮於稀釋液會造成水份或溶質移動，考量解凍後最佳的精子存活率，此過程水份自精子移出的速度顯著決定降溫的速率。一般而言，最佳降温速率介於80℃-120℃/分鐘，太快或太慢均可能使解凍後精子存活率偏低。冷凍前，精子在特定温度進行平衡有助水份的移動，降低精子冷凍與解凍時冰晶的損害。
　　冷凍精液中稀釋液的主要成份包含：維持滲透壓並具緩衝力的離子與非離子成份、防止冷休克的脂蛋白及高分子量物質例如蛋黃及牛乳、甘油與丙二醇或二甲基亞碸（DMSO）等抗凍劑、葡萄糖或果糖做為能量來源、酵素或抗生素等其他添加劑。稀釋液中添加蛋黃、牛乳及磷酸緩衝劑等，有助精子抵抗冷凍過程的抗冷休克，改善配種受胎率。
　　蛋黃添加到稀釋液，蛋黃中的卵磷脂可提供保護作用，使精子克服冷凍過程的冷休克。蛋黃以水、生理食鹽水及檸檬酸進一步萃取的脂蛋白可與精子細胞膜結合，脂質發揮温度絕緣作用，有助精子細胞膜保持穩定並通過關鍵温度區。稀釋液中蛋黃的添加量為稀釋液體積的15%到30%較適合，否則會顯著降低精子解凍後的存活力。
　　稀釋液中添加的冷凍保護劑以甘油最為普遍，在一般檸檬酸-蛋黃及Tris-蛋黃稀釋液約添加0.25M(2.25%)或1M(9%)的甘油是理想濃度，超過此範圍將對精子造成毒性。甘油具保護精子在冷凍過程的機械傷害。甘油及其他侵入性冷凍保護劑例如DMSO，可藉由防止細胞外溶液的濃縮而減少精子損傷。蔗糖和葡聚醣等非侵入性冷凍保護劑，可誘發冰晶格(ice crystal lattices)的形成，在精子細胞膜外形成屏障。
　　稀釋液中添加糖與多元醇，例如木醇、果糖、葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖和棉子糖等，可增加滲透壓並做為抗凍劑，與精子細胞膜上的脂質極性基形成氫鍵，亦能取代水分子而協助冷凍時細胞膜的穩定。糖也增加稀釋液的粘性而改變機械特性，強化稀釋液玻璃化的形成效率，有助於玻璃化冷凍之效率。
　　精液裝填於0.25或0.5ml的麥管置於液氮中冷凍保存，使用之冷凍設備有傳統慢速降溫儀或自動控制的程式降溫儀。使用上各有其優缺點，但精準的降溫控制相當重要，使麥管保存在均衡穩定的降溫程序，避免多層麥管間在降温時的溫度變異。一般程式降溫儀的降溫速率約介於150-300℃/分鐘之間。冷凍精液使用時，可置於35∼37℃的温水中解凍30秒。避免在空氣中或以其他方式自然解凍，以避免降低受胎率。

◆公牛冷藏精液之應用
　　精液在5℃保存2-4天，可降低精子的代謝作用而延長精子壽命，有利於精液的長途運輸。在冷藏稀釋液中，添加蛋黃、均質過的全乳、鮮乳、重組脫脂乳或椰子乳等，均已證明具有保護精子的能力。稀釋液中主要的緩衝成份如檸檬酸等，具有螯合性而改善蛋黃中蛋白成份的溶解性，可延長精子於冷藏時的存活力。其他成份在廣泛的pH範圍內添加，亦可提供精子良好的緩衝能力，包括：Tris、TES、MES、HEPES、PIPES、MOPS及BES等，其中以Tris為基礎的稀釋液應用最為普遍，搭配蛋黃與甘油，已證明解凍後具有良好的精子存活力與受胎率。含Tris的稀釋液也適用於牛精於常溫或冷凍保存之用。甘油少量添加於pH6.5的Tris稀釋液，對改善精子的受胎率遠優於未添加甘油者。

◆公牛冷藏與冷凍精液應用之優缺點
　　應用公牛冷藏或冷凍精液各有其優缺點。冷凍精液之主要優點，在於可長期保存公牛精液，因此允許個別高性能種公牛精液的長時間測試，對遺傳能力的證明具有價值。此外，在長期保存與應用上具有高度彈性，免除使用冷藏精液必需於短時間授精之壓力。冷凍精液的缺點，在於每次授精時需要較高濃度的精子始能達到如冷藏精液的水準。此外，精液需保存於液態氮容器，也需支出相當高的維護成本。使用冷藏精液之優點，在於可顯著降低每次授精的精子數，這也是為什麼紐西蘭或其他少數國家持續研發並改善冷藏精液製造技術的主因。此外，冷藏精液的保存成本很低，如果精液在製作後短時間內利用率很高，田間應用上相當方便且具高經濟價值。冷藏精液的唯一缺點是受限於保存期很短，製作的公牛精液必需於短時間使用。若公牛每次採得5ml的精液量，內含約75億(15億/ml)精子，約可製造350-500劑精子數為1.5-2千萬/麥管的冷凍精液。相同的精子數，足供製作約7,500劑精子數為1百萬/麥管的冷藏精液。未來在公牛冷凍或冷藏精液的研發將不會停止，對於公牛精液在保存過程的各種變化、稀釋液配方的調整、降温速率的最佳化、降低每次授精時的精子數等皆為重點方向，以期達到兼具冷凍與冷藏精液優點，改善精子冷凍解凍後的存活率，提升授精之受孕率。

◆主要參考文獻
Vishwanath, R. and P. Shannon. 2000. Storage of bovine semen in liquid and frozen state. Anim. Reprod. Sci. 62：23-53.

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