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蛋黃稀釋液與低密度脂蛋白
作為精子冷凍保護機制及其效應
新竹分所 李佳馨、蕭振文、葉亦馨、楊明桂
在精子冷凍過程中所使用之稀釋液(extender)、平衡培養時間以及冷凍過程等,均會影響精子冷凍解凍後之存活率及精子之受精能力。其中以蛋黃(eggyolk,EY)早已被證實對精子具有冷凍保護效果,可降低精子於冷凍過程受到冷休克之影響。且蛋黃稀釋液已廣泛運用於冷凍稀釋液60餘年,但近年已有許多學者提出蛋黃稀釋液之負面效應:(1)蛋黃為一營養生物培養液,可促進細菌與微生物孳生,故可能導致精液汙染發生,(2)蛋黃中之顆粒物質,會阻礙精子之代謝轉換作用或降低精子活動力及(3)蛋黃可能干擾精子生化檢驗分析結果等。以特定物種來說,山羊精液中由尿道球腺所分泌之蛋黃凝集酵素(egg yolk-coagulating enzyme, EYCE)可將蛋黃中之卵磷脂(lecithin)水解出不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid),其中脫羧卵磷脂(lysolecithin)具有高毒性,而其他不飽和脂肪酸所產生之酸性環境亦對精子有害。因此,尋求蛋黃稀釋液之替代物有其必要。
最早由蛋黃中觀察到低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)是由(1974年)Pace 和Graham兩個學者,他們以高速離心方式分離出低密度脂蛋白及高密度脂蛋白(Hight density lipoprotein, HDO),初步試驗中提出,LDL具有保護精子對抗低溫環境的能力,並觀察到高密度脂蛋白對精子有抑制作用。Demianowicz和Strezek (1996)將蛋黃分成兩種脂蛋白:LDL和高密度脂蛋白(HDL)。他們觀察到,如果LDL比卵黃提供更好的保護公豬精子,HDL與卵黃相比顯著降低精子運動力,並指出它是由於HDL中包含的顆粒。
LDL主要由蛋黃中所萃取出。LDL的結構大約由87%的脂質及12%的蛋白質所組成,其中脂質中三酸甘油脂佔 69%磷脂質佔26%及5%的膽固醇脂,形成一個直徑約35nm球形結構。皮膜部主要由磷脂質與蛋白質所組成,LDL內部則由三酸甘油脂及膽固醇脂所組成(圖一)。Hu等人(2010)利用超高速離心方式純化蛋黃液,發現蛋黃中之低密度脂蛋白 (low density lipoprotein, LDL)成分具有抗凍能力,可附於於精子細胞膜表面,穩定細胞膜之結構,對於冷凍解凍後之精子活力有較佳之表現,於稀釋液中添加8%LDL具有較佳之精子存活率與精子動力參數,且有利於精子維持較高之粒線體活性、頭帽與DNA完整性以及過氧化氫酶 (Catalase, CAT)、穀胱甘過氧化酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)與穀胱甘肽 (glutathione, GSH)等抗氧化酶活性。由於精子細胞膜中含有較多之不飽和脂肪酸,使其容易受到O2-及H
2O2的損傷,因此,細胞膜在冷凍或冷休克損傷時最先受到影響。保護精子抗氧化系統主要源自細胞質,但精子在細胞分化的過程中將細胞質排出於精子外,因此細胞質內缺乏有效的抗氧化物質成分,以抵抗活性氧(ROS)和脂質過氧化物質(Lipid peroxidation, LPO)所造成的破壞性效應。因此,精子細胞對過氧化損傷特別敏感,尤其是在冷凍保存後-隨後膜完整性喪失,細胞功能受損,運動性和受精能力降低。由於蛋黃和LDL在冷凍過程中,保護精子的確切機制是未知的。Amirat等人(2005)以電子顯微鏡觀察冷藏於4℃下(圖二),添加EY及LDL稀釋液中之精子,在EY稀釋液處理組於冷藏於4℃、1小時候發現有大量之蛋黃顆粒物質吸附於精子表面,其中觀察到有18%的精子質膜破裂,36%之精子有頂體反應或裂解之情形,僅46%的精子是完整的,而LDL處理組之精子質膜破裂僅佔0.28%,其精子完整性佔99.07%。其作者推測蛋黃顆粒物質會引起頂體反應(acrosomal reaction)或裂解作用而使精子死亡。
另精漿主要是公畜在射精時與附睪中之精子混和後,作為攜帶精子至雌性生殖道之載體。除此之外,精漿中之成分也提共精子活力,存活力及促進獲能作用所需。但也包含一些不利精子受精能力之因子,如去獲能因子、精子活力抑制因子,還有一些不利精子貯存之因子。其中早已由學者提出BSP蛋白,在公牛射精時結合到精子表面之膽鹼磷脂,可能藉由高密度脂蛋白和肝素誘導精子獲能作用,並進一步刺激精子細胞膜之膽固醇及磷脂之流失。Bergeron等人(2004)探討公牛精漿蛋白(bull seminal plasma protein, BSP如BSP-A1/A2,BSP-A3和BSP-30-kDa)與TG、EY及LDL稀釋液間之作用。研究顯示,精液中添加含有EY或LDL之稀釋液,其精子BSP蛋白量會減少50%-80%,並且在培養期間細胞膜之脂質顯著增加。由於LDL可與BSP蛋白產生螯合作用,可減少BSP主要蛋白與精子的結合,阻止精子細胞膜脂質流出,推測此應該是蛋黃與LDL稀釋液可作為精子冷藏冷凍之保護機制。
綜合上述,8%LDL可作為公牛精子冷凍稀釋液之良好介質,可避免蛋黃所造成之負面效應,並保護精子冷凍解凍後之線粒體活性、頭帽完整性、DNA完整性,以及CAT、GSH-Px與GSH之抗氧化酶活性。
後續已有許多作者提出,蛋黃中低密度成分,主要由LDL組成,可抗冷休克和改善儲存後精子的運動性。
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圖二、為精子頭部在電子顯微鏡下觀察冷藏於4℃達1小時的情形。 |
參考文獻