| 隨機小語 |
勞謙二字，受用無窮。勞所以戒惰，謙所以戒傲。
[曾國藩] |
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人工生殖技術：羊胚移置
EMBRYO TRANSFER OF GOATS
推 廣 場 所：
聯 絡 人：溫上湘 先生 謝瑞春先生
羊胚移置是什麼？
羊胚移置是應用人工技術的方法
來收集供胚羊子宮內的胚，再移置於另一受胚羊的子宮內，達到產下仔羊的目的。因此，羊胚移置技術可概分為誘導排卵、羊胚採集、保存和移置。
羊胚移置的用途：
- 可將具有優良性能之母羊，藉賀爾蒙處理超量排卵後，經與優良性能之公羊受精，胚經採集後，可利用胚移置技術以生產較多的優良後代。
- 避免疾病傳染：胚於體外經數次清洗後，可去除附著於透明帶上的細菌，如再經胰蛋白(Trypsin)處理，則可去除附著於透明帶之病毒。
- 胚移置可配合胚操縱技術進行胚分割、胚融合、胚核轉置、外源基因之注入或性別鑑定，以提高經濟效益。
- 羊胚可以冷凍方式半永久保存於液態氮中，以利羊之種原保存；且可以此方式進行國內各羊場或國際間的品種交流。
羊胚移置所需器材：
羊胚採集及移置可分為半外科手術、非外
科手術及外科手術三種方式，其操作所需器材如下：
一、羊胚移置操作前準備所需器材：
- 羊保定用棉繩一條；
- 5 ml，10 ml 注射筒（連針)；
- 基礎麻醉劑；如若夢 (Xylazine hydrochloride, RompumR), Atropine
Sulfate, Ketamine Hel；
- 刷子、肥皂、剃毛刀、手術擦洗液（如 Betadine)
等手術部位清洗用具；
- 碘酊，70 ％ 酒精等；
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二、胚採集和移置所需器材：
（一）半外科手術方式：
- 覆布固定鋏 (Towel forcep) 一套四支；
- 四號解剖刀柄及 20 號解剖刀片各一支；
- 直式或彎式凱利止血鉗 (Kelley hemostatic forcep) 各二支；
- 鼠齒鑷子 (Rat-tooth dressing forcep)及組織鑷子 (Tissue forcep)各一支；
- 手術剪刀 (Operating Scissor) 二支；
- 可利爾伍德 (Crile wood) 持針器一支；
- 外科角錐縫合針一支；
- 八號細導尿管 (Foley Catheter) 及導管細棒二支；
- 滅菌之胚沖洗液 (m-PBS) 50 ml/頭；
- 100 ml 滅菌燒杯二個；
- 5 ml,20 ml,50 ml 注射筒各一支；
- 手術縫合線 (00,1,及 2 號)；
- 消毒紗布塊一包；
- 羊隻固定用棉繩四條；
- 直徑 10 cm 培養皿 4 個；
- 立體顯微鏡；
- 陰道張開器一支；
- 授精棒一支；
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（二）非外科手術方式：
- 直式或彎式凱利止血鉗 (Kelley hemostatic forcep) 各二支；
- 陰道張開器（ 鏡）；
- 八號導尿管 (Foley Catheter) ，導管細棒各二支；
- 5 ml,20 ml,50 ml 注射筒各一支；
- 100 ml 滅菌燒杯二個；
- 滅菌胚沖洗液 ( 50 ml/頭）；
- 直徑 10 cm 培養皿 4 個；
- 立體顯微鏡；
授精棒一支；
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（三) 外科手術方式：
- 1.磨純尖端之 16 號注射針一支；
- 2.沖集用透明玻璃導管，直徑 1.0 cm 與 0.5 cm 各一支；
- 3.其他所需器材與半外科手術方式相同；
三、超量排卵所需器材：
- 1 ml,5 ml 注射筒（連針）；
- 藥品；如 FSH, PMSG；
供胚羊超級排卵：
供胚羊之超量排卵，使用賀爾蒙有 FSH 及 PMSG
其注射方式如下所示：
Method A:
Day 0: Estrus
Day 9: 4 mg FSH at a.m.
2 mg FSH at
p.m.
Day 10: 2 mg FSH at a.m.
2 mg FSH at
p.m.
1 mg PGF2α
at p.m.
Day 11: 2 mg FSH at a.m.
2 mg FSH at p.m.
Day 12: 2 mg FSH at a.m.
Estrus and Mating
Day 19: Embryo collection
Method B:
Day 0: Estrus
Day 9: 1500 iu PMSG
Day 11: 1 ml PGF2α
Day 13: Estrus and Mating
Day 20: Embryo collection
羊胚移置操作過程：
一、羊胚採集：
（一）半外科手術採集：
- 供胚羊保定：以細棉繩套於角部保定；
- 麻醉及消毒：供胚母羊均於採胚前一天下午起禁食，但仍應給飲水；母羊經肌肉注射若夢
(Rompum)，每公斤體重注射 0.11mg
的麻醉劑量，先行基礎麻醉，並皮下注射 5mg 的 Atropine Sulfate，以抑制唾液之分液；待10
分鐘後，經頸靜脈注射全身麻醉劑（如 Ketamine hydrochloride
），每公斤體重 0.55mg，使之昏迷，同時亦進行手術部位之清洗、剃毛及噴上碘酊做初步消毒。隨後立即將羊隻抬上油壓昇降手術台。羊隻仰躺後以棉繩將兩前肢及兩後肢各以屈曲張開的方式固定於手術台上，以利手術進行。
- 腹中線（或腹側）切開：當供卵羊保定完成後，以碘酊再消毒手術部位。首先由手術者將滅菌手術被布覆蓋於手術部位上，以覆布鋏固定之。手術者以右手持解剖刀沿腹中線（或腹側）切開約
10∼15
公分切創，剝開脂肪層及肌肉層後，再沿肌膜上的白線劃開，把腹膜暴露出來。隨即可用解剖刀切一小口或用手指刺破腹膜，並撕裂腹膜至肌膜層同寬。此時，將手伸入腹腔拉出子宮角、卵巢、輸卵管，並記錄卵巢上黃體的數目。
- 辨認出左或右子宮角後，以左手姆指及食指於腹腔內固定子宮頸，右手持已準備好的洗胚導管，助手同時將供胚羊陰唇張開，操作者將導管伸入陰道通過子宮頸管，選擇左或右子宮角使導管的氣球膨大後的位置，於子宮角分叉的前端，用
10ml 注射筒打入約 5ml
的空氣使氣球膨脹，緊貼於子宮襞，以防止沖洗液回流。助手使用
50ml 注射筒抽取置於 37℃恆溫水槽內之胚沖洗液 (Dulbecco's Modified PBS)，每次約灌注
10ml；操作者則以左手姆指及食指夾緊輸卵管末端與子宮角交接處，並輕輕按摩子宮角，使沖洗液回流至注射筒內，接入沖集皿(或燒杯)
中，連續 2∼3
次。另一子宮角隨即以相同方式沖洗。沖洗後，取置於 37℃
恆溫水槽內之生理鹽水 ( 0.9 ％ Saline) 約500ml
大量灌注腹腔中，以防止卵巢、輸卵管、與子宮角發生粘著。此時，採胚後之母羊依序縫合其腹膜、肌膜、皮下脂肪層及皮膚切創，然後塗佈消炎劑，降下手術台後鬆綁，待其恢復後趕回羊舍。
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（二）外科手術採集：
- 供胚羊保定、麻醉、消毒至手術部位之切創步驟與半外科手術方式相同。
- 辨認出左（右）子宮角後，以左手姆指和食指捏緊子宮角，用手術刀柄鈍端刺破子宮角腔壁，並自子宮角創口裝入胚沖集玻璃導管，由助手捏緊；以注射筒接上鈍頭注射針，吸入
20ml胚沖洗液 (Dulbec'cos modified PBS) 從輸卵管
喇叭口內穿入捏緊，後灌入沖洗液，然後沿子宮角上端向子宮體端以右手食指及中指夾緊按摩子宮角，使沖洗液沖過子宮角而從玻璃導管流出，接入燒杯或沖集皿中。另一側子宮角隨即以相同方式沖洗。
- 縫合與半外科手術方式相同。
（三）非外科手術採胚：
- 供胚羊保定：用細棉繩固定於圍欄或木柱，或請助手直接壓迫保定。
- 操作者左手食指或中指自直腸伸入固定子宮頸，右手持洗胚導管自陰道通入，至子宮角，導管氣球注入空氣使之膨脹以固定導管防止沖洗液回流，灌注沖洗液（勿使子宮角過於膨脹），並回收沖洗液。
- 由於非外科手術方式操作困難，故甚少使用。
二、尋胚及移置之處理：
- 將收集於沖集皿或燒杯內之沖集液分裝於直徑 10cm
培養皿中，於立體顯微鏡下尋胚。
- 將找到的胚，以微細玻璃吸管吸起，移到滅菌的胚沖集液中清洗
10 次，然後分裝於 0.25ml 麥管 (Straw) 中備用。
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三、胚冷凍及解凍處理：
（一）胚冷凍：
- 將清洗過的胚分別移入 5％ glycerol/18％ FCS/dPBS，10％
glycerol/18％ FCS/dPBS 培養液內各 10 分鐘，隨即將胚分裝於 0.25ml
麥管中，準備進行冷凍。
- 使用微電腦控制降溫設備 (minicool As25)
進行降溫，將含有胚的 0.25ml麥管橫置於 minicool As-25 中，由室溫至 -5℃
階段以 3℃／min 的速度降低，到 -5℃ 時自動植冰裝置 (Automatic Seedimg
System) 即自動進行結晶化 (Crystalization)，
使胚周圍的液體開始結冰，並維持在 -5℃ 5分鐘，之後開始進行第二階段降溫，降溫速度為
0.3℃／min ，直到 -35℃ 為止，此時，將含胚冷凍後的麥管直接倒入
-196℃ 液態氮中，完成胚冷凍的製備。
（二）解凍處理：
自 -196℃ 液態氮桶內取出麥管，迅速置於 20℃
水中，解凍約 10∼20 秒，將胚擠出，分別移入 9 ％ 甘油／0.3 M
蔗糖／18％ FCS／mPBS、6 ％ 甘油／0.3M 蔗糖／18 ％ FCS／mPBS 及 3 ％
甘油／0.3 M 蔗糖／18 ％ FCS／mPBS，培養液中各 10 分鐘，再移入 18 ％
FCS／mPBS 中清洗 3 次， 分裝0.25 ml 麥管中進行移置。
四、羊胚移置操作過程：
分為外科手術方式及非外科手術方式二種:
（一）外科手術方式：
- 受胚羊之保定、麻醉及消毒方式均與供胚羊胚採集相同。
- 受胚羊之腹中線切創如供胚羊；待手術開創到腹腔內後，拉出黃體側之子宮角、輸卵管及卵巢。
- 右手姆指及食指夾緊子宮角末端，以鈍頭針刺穿子宮角之肌層及子宮內腹層，再將裝有桑椹胚至孵化囊胚階段的羊胚之麥管（或玻璃細管）經由創口植入子宮角內，然後以麥管推棒（或吹氣）將麥管內（或玻璃細管）內之羊胚，植入子宮角腔內。
- 縫合，依供胚羊之方式依序縫合傷口，移入羊舍。到下一個正常發情週期時注意是否有發情回復之現象。
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（二）羊胚非外科手術移置：
- 經賀爾蒙處理發情，或自然發情後 7
天的受胚羊，保定後（與羊人工授精保定方法相同），先將外陰部拭淨，
並以 70 ％
酒精消毒，隨後準備已浸泡於良性消毒水內之陰道張開器，塗上潤滑劑，徐徐插入陰道內，張開陰道，尋得子宮頸口後，持止血鉗夾住固定子宮頸口，向後拉直。
- 將裝有胚之麥管，填裝於受精槍中，前端塗上潤滑劑後，外被塑膠保護套於頸口處，受精槍刺破保護套，伸入子宮頸內至一側子宮角腔中，推棒即將麥管內的羊胚推出，注畢後取出受精槍，同時張開器合攏後取出，即完成胚移置工作。
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羊胚移置之展望：
胚移置技術，在產業上的應用提高優良種畜的利用效率，加速優良種畜後裔之傳播範圍，減少疾病的散佈，促進基因之交換與保存，進而加速提高家畜育種改良。雖然羊隻的胚採集與移置，因其體型、子宮角之形狀及子宮頸皺襞的特殊構造和性質，使得非外科手術方式的發展一直難以突破。基於羊隻生殖科技化的發展需求及提昇國內羊胚採集與移置應用之普遍性，而期加速羊之育種改良，開發非外科技術和生殖細胞之低溫保存方法更待突破。家畜胚採集與移置，在牛、羊及豬方面均已有相當的發展與改良，對於新興生物科技，諸如胚原核顯微注射，體外成熟與體外受精，胚核轉置、胚分切、胚融合、胚冷凍、囊胚顯微注射等胚之顯微操縱技術的開發和應用，亦是最基本且最重要的「支援技術」─任何經生物技術操縱的胚移置技術的應用，移置到母體環境內，方能孳生後代。
參考文獻：
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implantation. P19-53.
- Webel, S. K. & Day, B. N, 1982. The control of ovulation. P197-210.
10.Ritar, A. J., Salamon, S. 1989. Ovulation and fertility in goats small ruminant
research, P323-331.
推廣人簡介：
溫上湘 ：台灣畜產試驗所恆春分所畜產系
美國堪薩斯大學碩士
謝瑞春 ：台灣畜產試驗所恆春分所畜產系
省立屏東農業專科學校三年制獸醫科
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