人工生殖技術：精液檢查

SEMEN EXAMINATION

精液檢查：

　　精液採集後應立刻放於維持 35℃ 之水浴中，並儘快進行精液檢查，精液量由集精瓶中量得，一般以毫升為單位。精液的外觀、色澤 、濃度等，應於最短時間內檢查完成。

一、精子活力之判定：

利用顯微鏡檢查精子活力及泳動速率，步驟如下：

1. 取清潔消毒之載玻片，加溫至 37.8℃ ，取一滴混合完全之原精液（精液輕緩轉動 2~3次，但勿強力振盪）於玻片上，必要時可蓋上蓋玻片，立即以顯微鏡低倍數觀查精子活動，並略估活精子百分率以及活動力。精子活動力等級判定為 0∼5 級評估法如下：
   5 級：精子活力極好，80 ％以上的精子活力良好。精子之漩 渦運動快速而明顯。
   4 級：精子活力很好，70∼80 ％的精子活力良好。精子之漩 渦運動很快，但較 5 級稍差。
   3 級：精子活力好，50∼75 ％的精子活力好。但由顯微鏡視 野所見之漩渦運動緩慢。
   2 級：活力平常，約 20∼50 ％的精子有活力。沒有漩渦運動 形成。
   1 級：活力差，低於 30 ％的精蟲有活力，且泳動緩慢不前進。
   0 級：無活力可辨別。
2. 為能精確判定精子活力之等級，稀釋過的精液也可用以上方法來評分，但具黏性的稀釋液可能會仰制精子 漩渦運動的形成，此時，應以精子前進運動速度及活力作為判定之依據。
3. 有些研究者使用活精子所佔的％，如 80％、70％、或 60％的方法判定精蟲活力，亦不失為一良好的之方法。任何判定精子活力之方法，其檢查步驟及結果均應有詳細的說明。

二、精子數計算：

（一）紅血球計數法：

　　應用紅血球計數盤來計算，計算最少 4∼5 大格（64∼84 個小方格） 內之精子數，其步驟如下：

1. 採得之原精液倒轉 2~3 次使混合均勻（勿強力振盪），吸 0.05ml 到標準紅血球稀釋管中，滴一個小氣泡於管內，並將管之末端拭淨 （氣泡可防止稀釋液滴入稀釋管前，精液因毛細作用而移動）。
2. 將稀釋液注入標準紅血球稀釋管中至標記 1.01mm 處一般可用 0.8 至 1％ 之NaCl 溶液作為稀釋液（通常家禽精子以 0.8 至 0.9％ ，而家畜精子以 0.9至 1％ ）。將稀釋管以手握振盪使混合完全 ，將最上之 4~5 滴混合液去掉（使管內之精液稀釋完全），在紅血球數盤上放置一蓋玻片，將稀釋過精液滴入蓋玻片下方。
3. 開始計算精子數前應將計數盤靜置數分鐘，於室溫中完成精子數計算。紅血球計數盤計算之方格數依據精液之濃度及玻片上精蟲分佈之情況而定。計算小方格總數80 格（ 1/20×1/20mm），所得之精子數 乘以 10,000 為 ml 之精子數目。若使用已稀釋之精液而非原精液，算得之精蟲數須乘以稀釋倍數，才能求得正確之精子數。

（二）光電比色法：

　　此法為計算精子數迅速而實用之方法。其原理是以光透過標準稀釋精液多少為依據。此比色計必須標準化，該標準化是先由血球計計算法決定已知精子濃度後，予以換算應用。

（三）視覺判定：

　　由不透明度快速判定精子濃度，其方法是製作不同濃度之不透明標準液。氯化鋇及硫化鈉可調製硫化鋇溶液。分為 5 個不同濃度，0.06、0.09 、0.12、0.15、0.18 ％ 即可應用。精液 1：枸鹽酸鈉稀釋液 10，稀釋後，與不同濃度標準液比較後，可快速了解精子濃度。

（四）紅血球數自動測定儀

　　此法目前為最快速，準確性最高之方法，在製造冷凍精液之場所，相當實用，唯儀器價錢較貴。

三、精子型態之判定：

　　由精子的外觀來判定好壞，其方法如下：

1. 滴 2~3 滴生理鹽水於乾淨之載玻片上，再滴一滴精液使混合，上蓋另一玻片而均勻分散， 置空氣中乾燥。
2. 以 Rose-Bengal 染色，乾燥 5~10 分鐘，再以蒸餾水洗去染色過度部份，然後乾燥，計算精子數。一般計算 333 隻精子，逢機取樣，以顯微鏡較高倍數（×1000）來進行，計算所得之異常精子數× 3／10，即為異常精子所佔％。Rose Bengal 染色劑配製： 3 gm 粉狀 Rose Bengal

　　　　99 ml 蒸餾水

　　　　1 ml 40 ％ 之福馬林

四、死、活精子之染色：

　　此法乃利用死、活精子吸收染色劑之差異性為依據。此試驗中，玻片上死亡之精子會吸收染色劑而呈藍色，活精子不吸收染色劑而無色。染色劑之配製法如下：

    A.染色劑 ─ 2 ％ 水溶性 eosin 溶於 M／8 之磷酸緩沖液中 (pH7.3)

　　磷酸緩沖劑：80.4 ml M／8 之 Na2HPO4

　　　　　　　　19.6 ml M／8 之 KH2PO4

    B.染色劑 ─ 1 份 Opal blur 加 1 份 M／8 的磷酸緩沖液

    A、B 染色劑等量混合，加熱過濾後備用。

染色之方法：

1. 滴 1~2 滴染色劑於乾淨載玻片上， 再滴入精液混合，上蓋另一片玻片，去除多餘之染色劑，並用布拭淨玻片邊緣，再將 2 玻片分開，置於加熱盤 (65℃) 上使乾燥。
2. 玻片乾燥後，以顯微鏡之高倍 (×1000) 來計數。通常計算精子 333 隻，逢機取樣，若部分精子僅核有染色，判定為死精子。活精子數可以公式＝活精子數× 3／10＝活精蟲數 ％ 。

五、冷休克：

　　活精子在冷震盪前以不同染色劑染色，可測定活精子所佔的％。其方法如下：少量稀釋過的精液樣品浸入 0℃ 水浴中 10 分鐘。俟冷休克後計算活精子的 ％。使用原精液時，很多精子會死，所以可依需要將原精液稀釋，取 1 ml 做試驗即可。稀釋液拌演緩沖 劑及精子抵抗冷休克之保護劑。冷休克後活精子的 ％，在適當貯存條件下，可望維持活力 2~5 天。

六、精子的糖分解反應：

　　精子的解糖作用乃其細胞酵素及其他還原物質所致，將葡萄糖還原成酸（乳酸或其他）。許多研究者認為精子解糖作用為精子活力之能量來源，與其存活率無關。影響精子解糖速率之因子如溫度、精蟲活力、糖濃度、氫離子 濃度、酸度等。測定精子解糖速率是一定時間間隔前後，測葡萄糖含量與乳酸含量之化學分析。培養液中葡萄糖含量減少，酸度上升之變化，與精蟲活力成正比。

七、精子的呼吸：

　　吸速率是吸收氧，排出二氧化碳，此與糖解作用有密切關係。影響精子呼吸速率之因素如稀釋液、稀釋速率、氫離子濃度、溫度、氣體、化學物質、精子新鮮度等。呼吸速率之測定可利用 Barcroft－warburge 呼吸率測定器或相似之方法來測定，測定時應控制精子濃度，及測定前後活精子所佔之％。而氧在限定範圍內變異大，所以培養基中吸氧量之測定是必須的。

八、美藍還原作用：

　　美藍溶液之配製： 50 公克美藍溶於 100 ml 3.6 ％ 之枸椽酸 鈉緩沖液中(Na3 C6H5O7 2H2O)。

　　試驗方法： 0.2 ml 精液與 0.8 ml 蛋黃-枸椽酸稀釋液混合使稀釋完全，加0.1 ml 的美藍溶液，混 合完全，上覆 0.5 英吋礦物油密封試管，將試管放入 43.3℃∼46.1℃ 熱水浴中，觀查美藍褪色所需時間。品質好之精蟲藍色褪去時間約 3∼6 分鐘，若美藍褪色時間超過 9分鐘 ，不適於受精使用，此種精液不是精蟲數目太少，即是精子活力太差。部份還原物質（酵素或細菌等）亦會使藍色褪去，而非精子所引起之褪色，故目前對還原時間未設定明確之標準。

九、家禽精子畸型及存活率檢查：

（一）染色液之製備

     1.染色液配方一： 
       Sodium glutamate. H2O 麩酸鈉           1.92g 
       Fructose or glucose 果糖或葡萄糖        0.6g 
       Sodium acetate (anhydrous) 無水醋酸鈉   0.51g 
       Magnesium acetate. 4H2O 醋酸鎂          0.08g 
       Potassium citrate. H2O 檸檬酸鉀         0.128g 
       溶於水中並泡成 100 ml （以蒸餾水） 
       每10ml溶液內加入0.16g eosin（水溶性）及0.6g nigrosin（水溶性）
     2.染色液配方二：
       Sodium citrate (Na3 C6 H5O7 2H2O) 檸檬酸鈉 3.6 g 
       溶於蒸餾水中並泡成 100 ml 
       每 10 ml 溶液內加入 0.16 g eosin 及 0.6 g nigrosin 

（二）鏡檢器材：

1. 75 mm×10 mm 試管
2. 載玻片(Acid-and alcohol-washed) 75 mm×25 mm
3. 蓋玻片(Acid-and alcohol-washed) 37.5 mm×22 mm
4. 顯微鏡 yellow-green 濾光片
5. 玻璃攪棒
6. 定量吸管 (0.02 及 0.5 ml)
7. 顯微鏡（須有 10×，40×及 100×接物鏡）

（三）鏡檢步驟：

1. 在 5℃ 冰水中放置一小試管，並加入 0.5 ml 染色液。
2. 在染色液中加入 0.02 ml 的精液並混合均勻（或是以 1 滴精液與 15 染色液的比例混合）。
3. 2 分鐘後搖動試管，並取出一滴置於載玻片上。
4. 在玻片作塗抹片，不易太厚或太薄以免影響觀察。
5. 以冷風吹風機迅速吹乾塗抹片。
6. 等完全乾燥後以 mounting fluid 滴在蓋玻片上，並覆 在載玻片之塗抹片之上。
7. 以油鏡(100×)觀察，計算 300 隻精子的形狀及存活， 以判定畸型率及存活率。

家禽精子生死鑑別，粉紅色(箭頭所指)者為死亡精，透明者為正常精子。