台灣畜產種原知識庫

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台灣黃牛與布拉曼牛先天性
下痢致死基因之檢測

林德育

摘要

　　牛先天性下痢致死基因為已知造成荷蘭乳牛經濟損失之重要遺傳疾病。為瞭解此不良遺傳疾病之基因在本省黃牛族群及拉曼牛中是否存在，本試驗乃採集台灣黃牛保種族群139頭黃牛及逢機採集70頭布拉曼牛血樣，以DNA萃取套組萃取白血球之DNA，經光電比色計測定其濃度後，利用BLAD檢測引子BLAD1 / BLAD2經PCR增幅後，將PCR產物(156bp) 分別以限制瓩HaeIII及TaqI 分切後，再經電泳分析結果進行判讀。正常牛 (TL，不帶有BLAD基因者) 經限制瓩 HaeIII 分切後電泳呈現116 bp / 40 bp兩條片段，帶有潛伏性先天性下痢致死基因及正常遺傳基因的雜合牛 (BL)，則呈現116 bp / 83 bp / 40 bp / 33 bp 四條片段，有病牛 (帶有純合型先天性下痢致死基因，BLAD) 則為83 bp / 40 bp / 33 bp三條片段；TL以限制瓩TaqI分切後電泳呈現 126bp/30bp兩條片段，BL則呈現156bp/126bp/ 30bp三條片段，BLAD僅呈現156bp單一片段。雖然由已進口之雜合型 (BL) 荷蘭牛精液數量，可推知此項不良遺傳基因在本省乳牛群中頻率亦很高，但在本試驗所有檢測之台灣黃牛及布拉曼牛均無此牛先天性下痢致死基因被檢出。由於純種肉、役用牛多採自然交配，故推估此項不良遺傳基因對本省肉、役用牛應影響不大。

緒言

　　淋巴球黏力缺失症(Leukocyte Adhension Deficiency, 簡稱為LAD)是一種發生於人類、狗及牛等多種動物的遺傳疾病，早在1974與1975年即發現了人類與狗的LAD，但是牛的LAD則直到1990年才被美國獸醫師柯里默（Marcus Kehrli）博士年在一項乳房炎防治的相關研究中發現，並命名為Bovine Leukocyte Adhension Deficiency，國際上簡稱為BLAD，目前已於荷蘭牛檢測出部份個體帶有此致死性體染色體隱性遺傳缺陷(Kehrli et al., 1990)。具有隱性純合型基因(BLAD)的仔牛常易受到感染而無法治療痊癒，於性成熟前死亡(Takahashi et al., 1987；Kehrli et al., 1992；Gilbert et al., 1993)。牛隻如果帶有這種遺傳疾病(遺傳型為擁有兩個突變的對偶基因，在此我們稱之為有病型)，仔牛通常在一歲齡以前，因無法建立完善的自衛系統，感染疾病而死亡 (Husten, 1992；Gilbert et al., 1993；Gerardi, 1996)。牛淋巴球粘力醣蛋白β-unit CD-18核甞序列經定序後，是一個有2310個核甞酸序列和769胺基酸的基因(Shuster et al., 1992a)。當第128個胺基酸天門冬酸被甘胺酸取代後，淋巴球粘力發生缺失，而這種胺基酸取代性的突變是導源於第383個核甞酸產生A到G單點突變(Shuster et al., 1992b)。這項單點突變導致原有的TaqⅠ分切點消失，而產生一個HaeⅢ分切點(圖1)。利用聚合瓩連鎖反應技術和限制瓩特性，Shuster et al. (1992b)可直接檢測牛隻DNA，並判讀其遺傳型為正常、雜合型或有病型 (隱性純合型)。有病型會產生牛淋巴球粘力缺失症被命為BLAD，而帶有突變基因的雜合型則命為BL；至於正常型牛隻則因檢測不到突變基因而命名為TL (Tested free of BLAD)。德國Tammen et al. 於1993年起，為篩除CD-18突變基因在牛群的頻率，重新設計一組聚合瓩連鎖反應的引子套組，產生101bp的DNA片段，經限制瓩分切後的片段型較易判讀(Tammen et al., 1996)；以色列Hochman et al. (1996) 亦重新設計一組引子配合牛胚性別和多項遺傳型之同步鑑定，可得知牛胚的CD-18遺傳型為TL、BL或BLAD者；而 Kriegesmann et al.(1997) 發展出另一組引子經聚合瓩連鎖反應後可產生更長之 DNA 片段(343 bp) ，經限制瓩分切後的片段型更易判讀。歐、美、日等國均發現在荷蘭牛族群中此基因頻率很高，例如 Jorgensen et al. (1993) 檢測694頭荷蘭公牛就發現有100頭帶有BLAD基因。然而在其它品種牛隻牛先天性下痢致死基因之檢測則未有報告。台灣省畜產試驗所恒春分所保有台灣黃牛 (Taiwan Yellow) 保種族群與布拉曼牛 (Brahman)，該黃牛族群是由本省各地及金門所收集而來並進行保種繁衍，而布拉曼牛則由國外進口後再行繁衍的族群。為瞭解牛先天性下痢致死基因在本省黃牛族群及拉曼牛中是否存在，乃進行該等族群篩檢。

材料與方法

一、試驗動物與採血

　　採集台灣省畜產試驗所恒春分所台灣黃牛保種族群139頭黃牛及逢機採集70頭布拉曼牛血樣。經頸靜脈採血，取得EDTA抗凝血劑的血樣3～5 ml。

二、核內DNA聚合瓩鏈反應（PCR）

　　血樣經一般生化步驟純化出核內DNA，以無菌水稀釋成模板DNA，俾進行PCR。反應物添加濃度與添加量如表2所示。各滴入兩滴礦物油後，離心一次，使油在上免除蒸發掉的問題。操作步驟在外吹式無菌操作櫃進行。引子核甞序列：

BLAD1： 5‘ GACCTTCCGGAGGTCCAAGG3’ (65.0％ GC)
BLAD2： 5‘ CCGAAACCAATGCTGCCCGA3’ (60.0％ GC)

	Forward Primer									aa
										sequence NO.
351	5'G	ACC	TTC	CGG	AGG	GCC	AAG	GGC	TAC
	Val	Thr	Phe	Arg	Arg	Ala	Lys	Gly	Tyr	125
						↑
	117					HaeⅢ


		TaqⅠ
		↓
376	CCC	ATC		CTG	TAC	TAC	CTG	ATG	GAC
	Pro	Ile		Leu	Tyr	Tyr	Leu	Met	Asp	134



			↑
			HaeⅢ

403	CTC	TCC	TAC	TCC	ATG	GTG	GAT	GAC	CTC
	Leu	Ser	Tyr	Ser	Met	Val	Asp	Asp	Leu	143

430	GTC	AAC	GTC	AAG	AAG	CTG	GGG	GGT	GAC
	Val	Asn	Val	Lys	Lys	Leu	Gly	Gly	Asp	152

				HaeⅢ
				↓
457	GTC	CTG	CGG	GCC	CTC	AAT	GGC	ATC	ACC
	Leu	Leu	Arg	Ala	Leu	Asn	Gly	Ile	Thr	161

			HaeⅢ
			↓					506
484	GAG	TCG	GGC	CGC	ATT	GGT	TTC	GG-3'		169
	Glu	Ser	Gly	Arg	Ile	Gly	Phe	Gly

						Reverse Primer

圖1. 牛CD-18 cDNA的部分核甞序列(351→506)和胺基酸序列。聚合瓩連鎖反應的正向引子和反向引子均修正一個核甞酸來消除HaeⅢ限制瓩分切點。CD-18突變點是第383個核甞酸由A突變為G，造成TaqⅠ分切點消失，但形成一個HaeⅢ分切點，胺基酸由甘胺酸取代天門冬酸。

表 2. 牛先天性下痢致死基因檢測 PCR 反應添加量

添加物	濃度	添加量
聚合瓩 Taq	5 U / m L	0.3 m L
引子 BLAD1	10 pmole / m L	1.0 m L
引子 BLAD2	10 pmole / m L	1.0 m L
dNTP	100 m mole / m L	1.0 m L
10X PCR Buffer		2.5 m L
無菌去離子水		9.2 m L
樣品 DNA	25~40 ng / m L	10.0 m L
總量		25.0 m L

PCR反應條件：
a.起動：94℃，5 分。
b.循環：94℃，30秒；65 ℃，30秒;72℃，30秒。共循環 40 次。
c.終止：72℃，5 分。

三、限制瓩切割

取PCR產物5 m L與限制瓩HaeIII (BM, 10 U/ m L) 1 m L、buffer 1 m L及3m L無菌去離子水於37℃反應3小時後進行電泳分析。
取PCR產物5 m L與限制瓩Tag I (BM, 10 U/ m L) 1 m L、buffer 1 m L及3 m L無菌去離子水於65℃反應3小時後進行電泳分析。

四、電泳與BLAD遺傳型鑑別

使用3.0 ％ Agar gel，以市售50 base pair ladder(BM)當作DNA片段大小標梯，於100伏特電壓，泳動60分鐘後呈相。依Hochman et al. (1996) 研究所列之片段型來判別。

結果

一、所有檢測之139頭台灣黃牛與70頭布拉曼牛的DNA樣品，利用BLAD檢測引子BLAD1 / BLAD2經PCR增幅後，在電泳圖上均產生約156 bp特異性的 DNA片段(圖2)，與荷蘭牛的DNA使用引子BLAD1 / BLAD2經PCR增幅後所呈現在電泳圖上之特異性的DNA片段相同，顯示在此兩個品種牛隻亦有BLAD基因序列。

p92.jpg (34208 個位元組)

圖2.正常牛(TL)、雜合牛(BL)與有病牛(BLAD)以引子BLAD1/BLAD2經 PCR 增幅所得 156bp PCR產物的未分切片段與再分別經限制瓩HaeⅢ 與 TaqⅠ分切後的片段之電泳相。

Y：台灣黃牛　B：布拉曼牛　H：荷蘭牛　M：marker

二、以限制瓩HaeIII分切PCR產物後在正常牛(TL, 不帶有BLAD基因)呈現116bp / 40bp的DNA片段，雜合型牛(BL, 帶有潛伏性BLAD基因及正常遺傳基因者) 則有116 bp / 83 bp / 40 bp / 33 bp四條DNA片段，有病牛(BLAD,帶有兩個潛伏性BLAD基因)則有83 bp / 40 bp / 33bp三條DNA片段；以限制瓩TaqI分切PCR產物後在正常牛呈現126 bp / 30 bp的DNA片段，雜合型牛則有156 bp / 126 bp / 30 bp三條DNA片段，有病牛則僅有156 bp單一片段 (圖2)。

三、所有檢測之台灣黃牛與布拉曼牛均不帶有潛伏性先天性下痢致死基因，顯示該不良基因應不致影響此兩個牛群。

結論

　　雖然由已進口之雜合型 (BL) 荷蘭牛精液數量，可推知此項不良遺傳基因在本省乳牛群中頻率亦很高，但在本試驗所有檢測之台灣黃牛及布拉曼牛均無此牛先天性下痢致死基因被檢出。由於純種肉、役用牛多採自然交配，故推估此項不良遺傳基因對本省肉、役用牛應影響不大。

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