保存細胞：黃牛胚 (Embryo of Yellow Cattle)

母黃牛　　　　胚       

製作儀器：

圖一、胚採集之一般用品

a.滴空瓶：裝盛 PBS 液 
b.潤滑劑：使操作者之手臂及胚採集之導管容易分別進入牛隻之直腸及生殖道內。 
c.5ml 注射筒：尾根麻醉及前列腺素之注射。 
d.70％ 酒精：消毒。 
e.麻醉劑(Procain)：尾根麻醉。
f.前列腺素（PGF2α，商品名 Estrumate Injection）：胚採集後注射之。 
g.抗生素 Penicillin（Penimycin）：胚採集後行肌肉及生殖道內注射，防止
  生殖道受感染。 
h.手套：直腸觸摸用。 
i.止血鉗：操作 Foley Catheter 入生殖道時使用。 
j.碘液（Betadine,Basle/Switzerland）：胚採集前，牛隻直腸及生殖道周
  圍區域之清洗消毒。 
k.500ml 量筒：裝盛採集液。

　
圖二、胚沖洗器具之一

a.Foley 氏導管（Foley Catheter）：前端上方為打氣孔，下端為沖洗液 及
  採集液之共同出入孔之末端為充氣後之氣球。
b.注精棒：置入導管中引導導管至子宮角。

圖三、胚沖洗器具之二

a.牛卵採集管（Bovine Egg Collection Catheter，英製 Franklin  Medical Ltd.）：
  為一三向式導管。上方為打氣孔，下方為沖洗液注入孔，中間為採 集液收回孔。
b.引導棒：探至子宮角後，下方較長者抽出，將導管伸入上方之空心棒即可達 子宮角沖洗。
c.50ml 注射筒：沖洗液之注入及採集液之回收。

圖四、胚沖洗器具之三

a.牛卵採集管（法製，I.M.V.）：手執端左方之細管為採集管道通至收集瓶；
  中間為沖洗液注入管道；右方為打氣孔。
b.20ml 注射筒：充氣用。
c.50ml 注射筒：沖洗液由前端下方管道抽入注射筒，再由上管道進入導管。
d.收集瓶：裝盛採集液。
e.沖洗瓶：裝盛沖洗液。
f.擴張器：裝置氣球於導管前端。

圖五、胚顯微操作器具

a.立體顯微鏡：胚顯微操作
b.細胞內培養液：10％ glycerol-20％ 1-2 propanediol
c.細胞外培養液：25％ glycerol-25％ 1-2 propanediol
d.稀釋液： 1M Sucrose
e.培養盤：裝盛胚採集液
f.吸量管(pipette)：胚顯微操作
g.麥管：胚冷凍貯存

圖六、電腦降溫機

冷凍胚製作方法：

(1)胚之採集：

圖七、以PBS液行非外科手數法洗胚 

(2)胚之冷凍：

A.玻璃化 (Vitrification)：

1. 將胚置於 10％ glycerol-20％ 1，2 propanediol／PBS 液中（室溫，10分鐘）若欲經培養，    則先以 PBS 洗過三次後，再於 20℃ 下置入 1M Sucrose／PBS 液 10 分鐘，然後在 37℃ 下於 PBS ＋ 20％ 胎牛 血清中培養 24 小時。
2. 若不培養，pipette 預先吸入 25％ glycerol-25％ 1，2 propanediol／PBS 液，再將胚吸入 pipette 中。
3. 0.25ml 或 0.5ml 的麥管先吸入 1M Sucrose／PBS 液及氣泡，將 pipette 內之溶液與胚吐入麥管中。
4. 麥管再吸入氣泡及 1M Sucrose／PBS 液，以麥管封口粉末封口。

  5.圖九中麥管 a 至 b 之部份於充填完後立即入液態氮中，然後麥管的其 餘部份再逐漸地投入液態氮中。

6.將冷凍之麥管移至液態氮筒中貯存。

B.一般方法：

(1)溶液之配製：
    溶液 A:PBS + 10％ FCS（54ml PBS + 6ml FCS =60ml）
    溶液 B:PBS + 10％ glycerol（27ml 溶液 A + 3ml glycerol = 30ml）
    溶液 C:PBS + 5％ glycerol（5ml 溶液 A + 5ml 溶液 B = 10ml）
(2)步驟：
   1.胚以 A 液洗三次（室溫下）
   2.胚入 C 液 5 分鐘（室溫下）
   3.胚入 B 液 10∼20 分鐘（室溫下）
   4.以 0.25∼0.5ml 之麥管，吸 B 液至 5cm 長，吸空氣，吸含胚之 B 液 4cm
     長，吸空氣，吸 B 液，最後封白粉。
   5.電腦控制降溫：
      20℃ ∼0℃ 迅速冷卻
      0℃∼-7℃ 1℃／min
      -7℃ Seeding 5∼10 分鐘後再保持 10 分鐘
      -7℃∼-35℃ 0.3∼0.6℃／min -35℃∼-196℃ 達
      -35℃ 後直接投入液態氮
   6.將製成之冷凍胚（麥管）移至液氮筒中貯存。

回目錄