新竹分所 施意敏、中興大學 莊士德、新竹分所 凃柏安

　　目前基因定序技術的進步，已升級至新世代又稱次世代定序技術（Next Generation Sequencing, NGS），可以在1-2天內完成基因定序，開啟各種環境體系微生物及瘤胃微生物菌群的研究。瘤胃微生物包括細菌、古生菌、真菌、原蟲等共生菌群（bacteriome），雖在厭氧的環境下生長，但因泌乳牛反芻的行為會帶進空氣至瘤胃，跟單胃動物腸胃完全厭氧的條件又不同，增加瘤胃微生物體外培養的困難度，尤其一些古生菌更不易於體外培養，限縮了我們對瘤胃微生物菌群的研究。
　　中興大學莊士德教授等人（Chuang et al., 2020）以次世代定序技術探討乳牛瘤胃共生菌群的豐富性。以臺灣北中南三個牧場的乾乳牛為研究對象，分別調查三個牧場乾乳牛之日糧組成（如表1）、乾乳前期產乳量與瘤胃微生物核心菌群的關係。A牧場的日糧組成以乾乳牛精料與進口百慕達草為主，10.71%粗蛋白質（CP）、60.90%粗纖維（CF），日糧粗精料比值（乾基）85.7：14.3。B牧場除了乾乳牛精料、進口百慕達草，尚餵飼新鮮狼尾草，日糧含 9.92% CP及66.79% CF，粗精料比值88.8：11.2。C牧場除了乾乳牛精料、進口百慕達草，並餵飼玉米青貯料及進口燕麥草，日糧組成包括13.20% CP及43.0% CF，粗精料比值（乾基）分別為67.5：32.5。乾乳前一期平均乳量分別為24.1±8.3、22.5±7.6、20.1±8.5kg。簡言之，精料比率C牧場32.5%>A牧場14.3%>B牧場11.2%，但三牧場乾乳牛的前一期乳量A牧場>B牧場>C牧場。
　　於乾乳後二周開始進行瘤胃液採樣，每牧場 5頭乾乳牛，以次世代定序技術進行基因定序，分析菌體 16S rDNA 基因共計24,390有效基因片段，共計1,406個操作分類單元（Operational Taxonomic Units, OTU），重疊交錯共同存在三個牧場，分別具有893、386、137個獨特的操作分類單元，存在於個別的牧場。一個OTU代表一段DNA序列的相似度達97%以上，但並非單一OTU完全對應單一菌種，某些物種間的基因序列相似程度大於 97%，因此分類出的 OTU中將包含多個物種，或是單一物種可能含有序列相似程度小於 97%的旁系同源基因，將造成此物種被區分至兩個或多個不同 OTU。雖是如此，三個牧場的瘤胃菌群存有 97%以上相似的基因序列片段為 1406個 OTU，具有相當程度的共通性，也各具一些獨特性的基因序列片段。
　　瘤胃液菌體 DNA分類的結果共計15門53屬，可以涵蓋 95%以上的菌門。以DNA 序列片段出現的頻度及與基因庫序列比對的結果，估算於菌體分類學上的相對豐富度，Firmicutes（厚壁菌門）A牧場<B牧場<C牧場。Bacteroidetes（擬桿菌門）A牧場>B牧場>C牧場。Proteobacteria（變形菌門）A牧場>B牧場>C牧場。Euryarchaeota（廣古菌門）A牧場<B牧場<C牧場（如圖2A）。Bacteroidia（擬桿菌綱）A牧場>B牧場>C牧場。Methanobacteria（甲烷桿菌綱）A牧場<B牧場<C牧場。Gammaproteobacteria（γ-變形菌綱）A牧場>B牧場>C牧場。Bacilli（芽孢桿菌綱）A牧場<B牧場<C牧場（如圖2B）。Prevotellaceae（普雷沃氏菌科）A牧場>B牧場>C牧場。Ruminococcaceae（瘤胃菌科）A牧場<B牧場<C牧場（如圖2C）。Prevotella（普雷沃氏菌屬）A牧場>B牧場>C牧場。Methanobrevibacter（甲烷短桿菌屬）A牧場<B牧場<C牧場。C牧場的 Ruminococcus（瘤胃球菌屬）及Streptococcaceae（鏈球菌屬）皆高於其他二牧場（如圖2D）。
　　LEfSe（Linear discriminant analysis effect size）是一種用於發現高維（highdimentional）生物標記和篩選基因組特徵的分析演算法，此演算法強調的是統計意義和生物相關性，能夠在處理組與處理組之間尋找統計上具顯著差異的生物標識（Biomarker），即處理組間在相對豐富度 (relative abundances)上具有顯著差異的物種。物種相對豐富度指特定物種於特定環境，相對於其他物種較常出現頻度，其計算方法為該物種相對於該環境出現總物種數目的比例。根據LEfSe分析的結果，主要的生物標誌A牧場為普雷沃氏菌屬，B牧場為Psudobutylvibrio（假丁酸弧菌屬），C牧場為擬桿菌屬、甲烷短桿菌屬、瘤胃球菌屬及鏈球菌屬。普雷沃氏菌屬與飼糧纖維含量成正相關，與粗蛋白質含量成負相關，與乾乳前期乳量成正相關。而擬桿菌屬、甲烷短桿菌屬、瘤胃球菌屬及鏈球菌屬與牧場飼糧蛋白質含量成正相關，與乾乳前期乳量成負相關。
　　換言之，Ｃ牧場粗精料比67.5：32.5，為高蛋白低纖維的飼糧配方，瘤胃菌群以擬桿菌屬、甲烷短桿菌屬、瘤胃球菌屬及鏈球菌屬為優勢菌群。A牧場粗精料比85.7：14.3，為高纖維低蛋白的飼糧配方，瘤胃菌群以普雷沃氏菌屬為主。該研究得到重要的結論，不同的乳牛場其乾乳牛的瘤胃菌群顯著不同，與飼糧組成及前期乳量變化具密切關係，提供乳牛營養專家以飼糧組成改變瘤胃菌群的操作方向，對提升乳牛乳量助益甚多。