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新竹分所 施意敏、中興大學 莊士德、新竹分所 凃柏安
目前基因定序技術的進步,已升級至新世代又稱次世代定序技術(Next Generation
Sequencing, NGS),可以在1-2天內完成基因定序,開啟各種環境體系微生物及瘤胃微生物菌群的研究。瘤胃微生物包括細菌、古生菌、真菌、原蟲等共生菌群(bacteriome),雖在厭氧的環境下生長,但因泌乳牛反芻的行為會帶進空氣至瘤胃,跟單胃動物腸胃完全厭氧的條件又不同,增加瘤胃微生物體外培養的困難度,尤其一些古生菌更不易於體外培養,限縮了我們對瘤胃微生物菌群的研究。
中興大學莊士德教授等人(Chuang et al.,
2020)以次世代定序技術探討乳牛瘤胃共生菌群的豐富性。以臺灣北中南三個牧場的乾乳牛為研究對象,分別調查三個牧場乾乳牛之日糧組成(如表1)、乾乳前期產乳量與瘤胃微生物核心菌群的關係。A牧場的日糧組成以乾乳牛精料與進口百慕達草為主,10.71%粗蛋白質(CP)、60.90%粗纖維(CF),日糧粗精料比值(乾基)85.7:14.3。B牧場除了乾乳牛精料、進口百慕達草,尚餵飼新鮮狼尾草,日糧含
9.92% CP及66.79%
CF,粗精料比值88.8:11.2。C牧場除了乾乳牛精料、進口百慕達草,並餵飼玉米青貯料及進口燕麥草,日糧組成包括13.20% CP及43.0%
CF,粗精料比值(乾基)分別為67.5:32.5。乾乳前一期平均乳量分別為24.1±8.3、22.5±7.6、20.1±8.5kg。簡言之,精料比率C牧場32.5%>A牧場14.3%>B牧場11.2%,但三牧場乾乳牛的前一期乳量A牧場>B牧場>C牧場。
於乾乳後二周開始進行瘤胃液採樣,每牧場 5頭乾乳牛,以次世代定序技術進行基因定序,分析菌體 16S rDNA
基因共計24,390有效基因片段,共計1,406個操作分類單元(Operational Taxonomic Units, OTU),重疊交錯共同存在三個牧場,分別具有893、386、137個獨特的操作分類單元,存在於個別的牧場。一個OTU代表一段DNA序列的相似度達97%以上,但並非單一OTU完全對應單一菌種,某些物種間的基因序列相似程度大於
97%,因此分類出的 OTU中將包含多個物種,或是單一物種可能含有序列相似程度小於 97%的旁系同源基因,將造成此物種被區分至兩個或多個不同 OTU。雖是如此,三個牧場的瘤胃菌群存有
97%以上相似的基因序列片段為 1406個 OTU,具有相當程度的共通性,也各具一些獨特性的基因序列片段。
瘤胃液菌體 DNA分類的結果共計15門53屬,可以涵蓋 95%以上的菌門。以DNA
序列片段出現的頻度及與基因庫序列比對的結果,估算於菌體分類學上的相對豐富度,Firmicutes(厚壁菌門)A牧場<B牧場<C牧場。Bacteroidetes(擬桿菌門)A牧場>B牧場>C牧場。Proteobacteria(變形菌門)A牧場>B牧場>C牧場。Euryarchaeota(廣古菌門)A牧場<B牧場<C牧場(如圖2A)。Bacteroidia(擬桿菌綱)A牧場>B牧場>C牧場。Methanobacteria(甲烷桿菌綱)A牧場<B牧場<C牧場。Gammaproteobacteria(γ-變形菌綱)A牧場>B牧場>C牧場。Bacilli(芽孢桿菌綱)A牧場<B牧場<C牧場(如圖2B)。Prevotellaceae(普雷沃氏菌科)A牧場>B牧場>C牧場。Ruminococcaceae(瘤胃菌科)A牧場<B牧場<C牧場(如圖2C)。Prevotella(普雷沃氏菌屬)A牧場>B牧場>C牧場。Methanobrevibacter(甲烷短桿菌屬)A牧場<B牧場<C牧場。C牧場的
Ruminococcus(瘤胃球菌屬)及Streptococcaceae(鏈球菌屬)皆高於其他二牧場(如圖2D)。
LEfSe(Linear discriminant analysis effect
size)是一種用於發現高維(highdimentional)生物標記和篩選基因組特徵的分析演算法,此演算法強調的是統計意義和生物相關性,能夠在處理組與處理組之間尋找統計上具顯著差異的生物標識(Biomarker),即處理組間在相對豐富度
(relative
abundances)上具有顯著差異的物種。物種相對豐富度指特定物種於特定環境,相對於其他物種較常出現頻度,其計算方法為該物種相對於該環境出現總物種數目的比例。根據LEfSe分析的結果,主要的生物標誌A牧場為普雷沃氏菌屬,B牧場為Psudobutylvibrio(假丁酸弧菌屬),C牧場為擬桿菌屬、甲烷短桿菌屬、瘤胃球菌屬及鏈球菌屬。普雷沃氏菌屬與飼糧纖維含量成正相關,與粗蛋白質含量成負相關,與乾乳前期乳量成正相關。而擬桿菌屬、甲烷短桿菌屬、瘤胃球菌屬及鏈球菌屬與牧場飼糧蛋白質含量成正相關,與乾乳前期乳量成負相關。
換言之,C牧場粗精料比67.5:32.5,為高蛋白低纖維的飼糧配方,瘤胃菌群以擬桿菌屬、甲烷短桿菌屬、瘤胃球菌屬及鏈球菌屬為優勢菌群。A牧場粗精料比85.7:14.3,為高纖維低蛋白的飼糧配方,瘤胃菌群以普雷沃氏菌屬為主。該研究得到重要的結論,不同的乳牛場其乾乳牛的瘤胃菌群顯著不同,與飼糧組成及前期乳量變化具密切關係,提供乳牛營養專家以飼糧組成改變瘤胃菌群的操作方向,對提升乳牛乳量助益甚多。
參考文獻
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圖 1.
中興大學莊士德教授進行乳牛瘤胃液採樣。A: 由乳牛口腔插入胃管(箭頭所指)。 |
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圖 2. 乾乳牛的主要瘤胃菌群分類的結果(A)門(B)綱(C)科及(D)屬。 |