蘭嶼豬種：從卵胚冷凍到複製

吳明哲 陳立人 李秀美

台灣省畜產試驗所生理系

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家畜生殖細胞(包括精子、卵細胞及胚)之冷凍保存，不但可以提供做為家畜種原保存的一種方式，也是一種經濟有效的引種或種原交換與交流的手段。透過這個技術的推廣及應用，可以迅速而廣泛地傳播優良的基因，以促進畜群的性能表現，並提昇育種改良之速率。在生命科學研究上，家畜生殖細胞的冷凍更可以用以提供大量的研究材料，並可做為生殖細胞操縱時之支援技術。家畜生殖細胞的冷凍保存肇始於精子冷凍技術之開發。而家畜胚之冷凍，在國外以小鼠胚為材料於1972年發展成功後，牛胚、綿羊胚、山羊胚及馬胚也相繼有冷凍成功且冷凍胚移置後成功產仔之結果。國內豬胚之冷凍保存的發展較晚;且不若牛精子和牛胚之冷凍保存已進入商業應用之階段，大多尚處於試驗研究階段。豬卵細胞目前已有解凍後存活並仍具有受精能力者，惟其成功的百分率均遠比胚冷凍者為低。

本土品種蘭嶼種母豬的豬卵，係以外科手術法採集。每頭母豬於其後頸部以皮下注射的方式給予1000國際單位之孕馬血清激性腺素，72小時後再於其後腿部肌肉注射500國際單位之人類絨毛膜激性腺素。並於HCG注射後42到46小時進行腹部外科手術，以含0.4%牛血清白蛋白的細胞培養用杜比克氏磷酸緩衝改良液沖集其輸卵管內之卵細胞，選取卵細胞型態完整和有卵丘細胞被覆之卵做為冷凍用豬卵，再依有無第一極體排出來區分極體形成前或極體形成後豬卵兩群供試。極體形成的豬卵之卵丘細胞已擴散，而極體形成前的豬卵被覆在外的卵丘細胞較緊密，需先以0.5%硫璃醣去氫酵素來軟化並去除之。因此，所有的豬卵均已去除卵丘細胞。

體內成熟的豬卵經外科手術自輸卵管內回收後，置於內含1.5M甘油、20 mg/ml第三型抗凍蛋白和15%胎牛血清的杜比克氏磷酸緩衝改良溶液，再分裝入0.25 ml冷凍麥管，由25℃以每分鐘降1℃之速率降溫到-6.8℃，讓其停留在-6.8℃達10分鐘後，再以每分鐘0.3℃的速率降到-30℃，經2~3分鐘後直接移入液氮冷凍保存。解凍步驟則直接把冷凍麥管投入30℃水浴槽，並於溫水中搖動麥管，約一分鐘取出以70%酒精擦拭麥管外壁，再把解凍卵放入含有1.5M甘油、0.3M蔗糖和16%胎牛血清的杜比克氏磷酸緩衝改良溶液透析10分鐘，隨之把解凍卵移入含有0.3M蔗糖和16%胎牛血清的杜比克氏磷酸緩衝改良溶液透析5分鐘，再逐滴加入僅含16%胎牛血清的杜比克氏磷酸緩衝改良溶液，歷時五分鐘至達2ml體積量，然後以16%胎牛血清的杜比克氏磷酸緩衝改良溶液洗滌三次，完成解凍步驟。豬卵不具第一極體者經冷凍解凍後，存活率為0%(0/103)；而豬卵具第一極體者之存活率有79%(45/57)。存活卵經體外受精與培養，有29%(14/49)的卵發育至桑椹胚。

豬胚的冷凍保存，有許多困難尚待克服。卵胚的細胞質易因冷凍解凍而產生微細變化，利用細胞質裡粒線體特定用活性螢光染色劑薔薇紅來觀察冷凍解凍後的卵和胚，粒線體顆粒若聚集成雪花片狀，則無法進一步培養發育。發育遲滯的胚有米粒狀和片塊狀粒線體聚集。急速冷凍的豬卵，若再經二次冷凍，粒線體聚集成片塊狀的頻率由0%增加為22%，暗示冷凍解凍步驟對冷凍細胞之細部會有損害，並可藉螢光鏡檢來得知。

豬胚置於含有1.5M甘油冷凍保護劑之麥管中，以慢速冷凍法植冰後，再保存於液態氮桶，蘭嶼豬種的擴張囊胚之冷凍存活率有37.3%（19/51），而藍瑞斯和杜洛克豬種者則分別為5.4%(6/110)和9.4%(5/53)。蘭嶼豬種的豬胚從單細胞、雙細胞、四細胞、八細胞、桑椹、早期囊胚、擴張囊胚到孵化囊胚的冷凍存活率分別為19.2、0.0、6.8、6.5、26.3、5.9、36.1和75.6%。目前國內的豬胚冷凍解凍後，尚未有存活仔豬的記錄，故利用冷凍豬胚的種原保存方式，仍待突破技術上的瓶頸。

細胞質遺傳在品種改良上漸受重視，細胞質內含物中粒線體具有可自行複製的環狀雙股 DNA，粒線體 DNA 為母系遺傳，經由卵細胞遺傳給子代，而精細胞在形成精子時，會失去大部分的細胞質，只有細胞核進入卵細胞中與卵結合成受精卵，故子代的粒線體 DNA 係來自雌親而與母系相同，因而粒線體 DNA 可供追溯其雌親種原。

哺乳動物粒線體 DNA 序列具高度同源性且大小相近，約為 16.5Kb，並無蛋白質附著於上，其中豬的粒線體 DNA 為 16.35Kb。粒線體 DNA 以獨特的 D-loop 機轉進行複製，其突變率較核內基因高出約 5-10 倍，又無校讀及 DNA 修補系統。

採外觀認定的國內六個主要豬種：藍瑞斯（L）、約克夏（Y）、杜洛克（D）、漢布夏（H）、桃園（T）和迷你型蘭嶼（M），此六個品種豬在外觀上呈現不同的差異程度，但彼此間均能雜交配種，故利用限制酵素來分切其粒線體DNA 成片段，藉以區分雌親品種。限制酵素HindⅢ 將各品種豬之粒線體 DNA 均分切成四個片段，其 DNA 片段大小組成型為 9.19/4.25/2.42/0.49 Kb。限制酵素 StuⅠ將雌親品種為 L、D 與 H 豬之粒線體 DNA 分切成九個片段，而將雌親品種為 Y、M 與 T 豬之粒線體 DNA 分切為八個片段，暗示 L、D 與 H 為同一雌親遺傳類型，而 Y、M 與 T 為另一雌親遺傳類型。限制酵素 BglⅡ則可將雌親品種為 L、D 與 H 豬之粒線體 DNA 分切成三個片段，其 DNA 片段大小組成型為 7.36/4.57/4.42 Kb；將雌親品種為 M 豬之粒線體 DNA 分切成二個片段，其 DNA 片段大小組成型為 8.99/7.36；而將雌親品種為 Y 與 T 豬之粒線體 DNA 分切為一個片段（16.35kb）。

國內現有的六個品種豬依其雌親粒線體 DNA 之限制酵素HindⅢ-BglⅡ-StuⅠ分切片段數概可分為三大類：4-3-9 的藍瑞斯、杜洛克與漢布夏豬種；4-1-8 的約克夏與桃園豬，以及 4-2-8 的迷你型蘭嶼豬。依據各品種豬粒線體 DNA 之限制酵素HindⅢ-BglⅡ-StuⅠ片段型所估算該六個品種豬之間核甘酸變異率所示類緣關係，在血緣關係上以 Y 、T 和 M 較為接近，其相對核甘酸變異率為 2.02%，進一步將 Y、T、M 視為同一群組估算其與 L、D、H 之相對核甘酸變異率為 7.15%。

蘭嶼豬種的特有粒線體DNA片段型和在養豬數目稀少，兩項要素促使我們於1989年研擬蘭嶼豬種的複製計畫。我們以蘭嶼豬胚為核的供應來源，但以白色且大耳的藍瑞斯豬種為卵的提供者。當把胚核取出後，就轉置到去核的成熟卵，經電融合後，把18個核轉置卵移置於肉用三品種母豬的輸卵管內，於1991年3月3日產下一胎8頭核轉置豬，計有6頭活仔豬和兩頭死產。由於僅使用雙細胞期和四細胞期的胚為核源，產下的6頭活仔豬中有兩頭公的和4頭母的。這些仔豬長大後，外型為蘭嶼豬特徵但具有稍大而下垂的耳朵，經正反交測試所生的後裔外觀比較，證實耳朵的外表型受到母性遺傳的粒線體DNA片段型之影響。間接地說明複製所用的卵源是複製個體的外表型變異的遺傳因素之一。